¿En que consiste el rRT-PCR usado para identificar el virus Influenza A H1N1?

La idea de replicar secuencias de ADN in vitro de la misma manera que los seres vivos, comenzó en los 70s con procedimientos que tardaban muchas horas. No fue hasta 1983 cuando Kary Mullis ideó un método con enzimas de bacterias de aguas termales capaces de resistir las altas temperaturas necesarias para desnaturalizar el ADN y así exponer las hebras permitiendo su replicación. Mullis ganó el Premio Nobel por su diseño de la reacción en cadenas de la polimerasa (PCR), un procedimiento que revolucionó la biología y la medicina.

Como la PCR necesita obligatoriamente que el molde sea ADN, para la amplificación de ARN se ideó un paso anterior de transformar este ARN en ADN, tal como hacen los virus ARN, utilizando una enzima denominada transcriptasa reversa (RT), así nació la PCR reversa o mejor conocida como RT-PCR. El descubrimiento de la RT valió el Premio Nobel de Fisiología o Medicina a David Baltimore y Howard M. Temin.

Uno de los problemas de la PCR convencional era la dificultad en realizar la cuantificación absoluta de los ADNs amplificados, lo cual se resolvió en 2000 con la introducción de la PCR en tiempo real (o PCR cuantitativa).

Además de los dos cebadores (o primers), nuleotidos sustratos, iones, ADN molde y ADN polimerasas, la PCR en tiempo real utiliza una sonda (probe) de hidrólisis unida a dos fluorocromos que hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo (forward primer) y el inverso (reverse primer). Cuando se amplifica el ADN, la sonda permanece intacta y genera una señal fluorescente, la cual es cuantificable. Otras características de la PCR en tiempo real es su alta sensibilidad que disminuye el riesgo de falsos negativos y su rapidez que ayuda a tener menos probabilidad de contaminación y los consecuentes falsos positivos.

El protocolo del CDC de Atlanta para la detección y caracterización del virus Influenza A H1N1 es un rRT-PCR (r = tiempo real, RT = transcriptasa reversa, PCR; en corto ‘PCR reversa en tiempo real’) por ser un virus ARN. Esta prueba contiene además de la sonda de hidrólisis, un cebador denominado InfA para la detección universal de los virus Influenza A, un cebador y una sonda denominados swInfA que amplifican e identifican respectivamente a los virus Influenza A porcinos, y un cebador y una sonda denominados SwH1 para ampliar e identificar a los virus Influenza H1 porcinos.

(Fuente Wikipedia y medmol.es)

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